首发人工合成叶黄素工艺流程

◉ 李田

人工合成叶黄素工艺流程

一、菌株选择与工程化改造

1、 菌株选择

选用谷氨酸棒杆菌作为生产叶黄素的宿主菌株。这是因为谷氨酸棒杆菌具有良好的生长特性和代谢能力，是一种常用的工业生产菌株，对其进行基因操作相对容易，并且具有较高的遗传稳定性。

2、 代谢途径改造

（1）基因编辑：通过基因工程技术对谷氨酸棒杆菌的基因组进行编辑。识别并修改与叶黄素合成相关的代谢途径中的关键基因，增强相关酶的活性或增加酶的表达量，使得代谢流更多地流向叶黄素合成途径。

（2） 引入外源基因：从其他具有高效叶黄素合成能力的生物中克隆相关基因，并将其导入谷氨酸棒杆菌中，以补充或增强其自身的叶黄素合成能力。这些外源基因可能编码参与叶黄素合成的关键酶，如八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶等。

3、血红素合成及电子传递系统优化

（1）血红素合成优化：对参与血红素合成的基因进行调控，增加血红素的合成量。血红素是许多酶的辅因子，在叶黄素合成过程中可能参与某些关键酶的催化反应，因此充足的血红素供应有助于提高叶黄素的合成效率。

（2）电子传递系统优化：改造电子传递系统相关基因，提高电子传递效率。电子传递在细胞的能量代谢和生物合成过程中起着重要作用，优化电子传递系统可以为叶黄素合成提供更多的能量和还原力（如NADPH）。

二、发酵培养

1、 种子培养

（1）培养基配制：选择适合谷氨酸棒杆菌生长的培养基，通常包含碳源（如葡萄糖）、氮源（如酵母提取物、蛋白胨）、无机盐（如磷酸盐、硫酸盐）等营养成分。根据菌株的特性和培养要求，调整培养基的配方和pH值。

（2） 接种培养：将经过工程化改造的谷氨酸棒杆菌接种到种子培养基中，在适宜的温度（一般为30 - 37℃）和摇床转速（通常为150 - 250 rpm）下培养，使菌株处于对数生长期，为后续的发酵培养提供足够数量的活性细胞。

2、 发酵罐培养

（1）发酵罐准备：对发酵罐进行清洗、灭菌处理，确保发酵环境无菌。将配制好的发酵培养基加入发酵罐中，并进行灭菌。

（2）接种发酵：将种子培养液按照一定的接种量（通常为5% - 10%）接入发酵罐中。在发酵过程中，通过控制系统维持发酵罐内的温度、pH值、溶解氧等参数在适宜的范围内。例如，温度可控制在30 - 37℃，pH值维持在6.5 - 7.5，溶解氧浓度根据菌株的需求进行调节。

（3）补料策略：根据发酵过程中菌株的生长和代谢情况，采用适当的补料策略。例如，在发酵前期，为了满足菌株的快速生长，可适量补充碳源和氮源；在发酵后期，为了促进叶黄素的合成，可调整补料成分，增加前体物质的供应。

三、叶黄素提取与纯化

1、细胞收集

发酵结束后，通过离心或过滤等方法将发酵液中的细胞收集起来。离心条件一般为4000 - 8000 rpm，离心时间为10 - 20分钟。

2、细胞破碎

采用物理或化学方法将收集到的细胞破碎，使叶黄素释放到溶液中。常用的物理方法有高压匀浆法、超声破碎法等；化学方法可使用有机溶剂乙醇+丙酮处理细胞。

3、 提取

将破碎后的细胞悬液与有机溶剂正己烷+石油醚混合，进行萃取操作。叶黄素具有较好的脂溶性，能够溶解在有机溶剂中。通过多次萃取，提高叶黄素的提取率。

4、纯化

（1）粗分离：采用过滤、离心等方法去除萃取液中的杂质和不溶性物质。

（2）精细纯化：通过柱色谱、结晶等方法对叶黄素进行进一步的纯化。柱色谱可选用硅胶柱、氧化铝柱等，根据叶黄素的性质选择合适的流动相进行洗脱。结晶过程可通过控制温度、溶剂组成等条件，使叶黄素结晶析出，从而得到高纯度的叶黄素产品。

四、质量检测

1、含量测定

采用高效液相色谱（HPLC）等方法测定叶黄素的含量，确保产品达到克级每升（如1.78 g/L）的产量要求。

2、 纯度分析

通过紫外 - 可见光谱、核磁共振（NMR）等技术分析叶黄素的纯度和结构，保证产品的质量和稳定性。

3、其他指标检测

检测产品中的杂质含量、水分含量、微生物指标等，确保产品符合相关的质量标准和安全要求。

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